293T細胞にガイドRNA発現ベクターとCas9発現ベクターを導入して、DNAの切断を行う。トランスフェクションには PEI を用いる。

100%コンフレンシー（フル・コンフレンシー）の293T細胞を5分の１希釈して撒く（20％コンフレンシー）。翌日40－50％コンフレンシーの状態になっている。

２４穴プレートの場合、1ウェルの培養液を捨て、OptiMEM 400マイクロリットルを加え1時間37度で培養する。

PEI (Polyethylenimine ポリエチレンイミン）は1mg/ml の濃度で水で溶解し、塩酸を加えて完全に溶解させる。滅菌フィルターで滅菌し、冷凍して保存する。

24穴プレートの1ウェルを用いる場合、

ガイドRNA発現ベクター 0.53マイクログラム
Cas9 発現ベクタ―（T2A配列でGFPと結合）0.53マイクログラム
を 6.6 マイクロリットルの OptiMEM で溶解。

PEI 4.5マイクロリットル（DNA:PEI比　1:6) と混合しボルテックスで良く混ぜる。

室温で10分間静置し、1滴づつ培養液に混和しながら滴下。

6時間　37度の培養箱の中で反応

反応液を破棄し、新しいD-MEM(10%FCS, PCG/SM) を１ml加えて3日間培養（3日間目が発現量が最大）。蛍光顕微鏡でGFP発現細胞を確認する。

（DNA:PEI 比は１：３や１：４では導入率が極めて悪い。我々の実験では１：６で70％以上の導入（GFP陽性細胞・目視によるカウント）が達成できる）